울릉국화 엑소좀의 항노화 활성 효과 연구
울릉국화 엑소좀의 항노화 활성 효과 연구
김 민 하†ㆍ윤 은 정ㆍ김 정 수ㆍ배 소 현ㆍ최 나 영ㆍ박 시 준ㆍ이 현 상††
㈜에이바이오머티리얼즈
(2024년 9월 5일 접수, 2024년 9월 27일 수정, 2024년 9월 28일 채택)
study on the anti-aging activity of chrysanthemum lucidum exosomes
min-ha kim†, eun jung yoon, jung soo kim, so hyun bae, na young choi, si jun park, and hyun sang lee††
abio materials co., ltd. 7-44, jamsil-gil, seonghwan-eup, seobuk-gu, cheonan-si 31005, korea
(received september 5, 2024; revised september 27, 2024; accepted september 28, 2024)
요 약: 울릉국화(chrysanthemum lucidum, c. lucidum)는 국화과의 여러해살이풀로, 경북 울릉도에만 분포하
는 고유종으로, 이전 연구에서 울릉국화 추출물의 높은 폴리페놀 및 플라보노이드 물질 함량이 높아 우수한
항산화 활성이 보고되어 있으나, 울릉국화 추출물의 주름개선, 세포재생 등과 같은 항노화와 관련된 효능은
잘 알려져 있지 않으며, 울릉국화 유래 엑소좀(c. lucidum-derived extracellular vesicles, cldevs)에 대한
활성 연구는 전무한 실정이다. 따라서, 본 연구에서는 in vitro 및 인체적용시험을 통해 cldevs에 대한 항노화
활성 효과를 검증하였다. in vitro 세포 실험에서, cldevs는 세포 재생을 촉진하고, 콜라겐 합성 유전자인
col1a1의 발현을 증가시켰고, 피부 장벽 개선 관련 바이오마커 유전자인 lor 및 flg의 발현을 증가시켰다.
또한, 노화를 유도시킨 세포에서 노화 관련 바이오마커인 cdkn2a (encodes p16) 및 tp53 (encodes p53) 유전자
의 발현을 억제시켰다. 인체적용시험에서 cldevs가 함유된 화장료를 4 주간 사용 후 눈가주름 및 팔자주름
개선을 평가한 결과, 4 주 후 통계적으로 유의한 수준의 주름 개선 효과를 나타내었다. 결론적으로 cldevs는
주름 개선 및 항노화를 위한 바이오 화장품으로서 높은 응용 가능성을 입증하였다.
abstract: chrysanthemum lucidum (c. lucidum), a perennial herb in the asteraceae family, is an endemic species found
only on ulleung island in gyeongsangbuk-do, south korea. previous studies have reported that the extract of c. lucidum
exhibits excellent antioxidant activity due to its high polyphenol and flavonoid content. however, the anti-aging effects
of c. lucidum extract, such as wrinkle improvement and cell regeneration, are not well known, and there has been no
research on the activity of c. lucidum-derived extracellular vesicles (cldevs). therefore, this study aimed to verify the
anti-aging effects of cldevs through in vitro and clinical analyses. in cell experiments, cldevs promoted cell regeneration,
increased the expression of col1a1, a gene involved in collagen synthesis, and enhanced the expression of flg and
lor, a biomarker related to skin barrier improvement. additionally, cldevs suppressed the expression of aging-related
biomarkers, such as the cdkn2a (encodes p16) and tp53 (encodes p53) genes, in cells induced to age. in a human
clinical trial, after using a cosmetic product containing cldevs for 4 weeks, significant improvement in wrinkles around
the eyes and nasolabial folds was observed. in conclusion, cldevs have demonstrated high potential as a bio-cosmetic
ingredient for wrinkle improvement and anti-aging.
keywords: cosmetic, chrysanthemum lucidum, exosome, extracellular vesicles, anti-aging
대한화장품학회지, 제50권 제 3 호, 2024
290
1. 서 론
울릉국화(chrysanthemum lucidum, c. lucidum)는 국화과에 속하는 다년생 초본식물로, 대한민국 경상북도 울릉도에서만 자생하는 특산 식물이다[1]. 잎은 길고 가늘게 갈라지고 갈래는 피침형으로 두껍고 광채가 나며 잎자루가 있는 것이 특징이다. 한방에서는 울릉국화의 전초를 부인병,중풍, 신경통, 식욕부진 등의 적응증에 대한 약재로 사용했으며, 최근에는 옥상녹화를 위한 식물로 주로 이용되고있다[2]. 기존 연구에서는 울릉국화의 꽃과 잎, 줄기 추출물에 대한 항산화 연구가 보고되었다[3].피부노화(skin aging)는 노화에 따라 피부의 각질층에서장벽의 기능이 약해지면서 수분 보유 능력이 감소하고, 진피층에서는 섬유아세포의 콜라겐, 엘라스틴과 같은 세포외 기질(extracellular matrix, ecm) 생성 기능이 감소함에 따라 피부가 얇아지고 주름이 발생하며, 탄력이 감소된다[4,5]. 또한, 세포의 전반적 기능이 저해되면서 상처에 대한 치유 시간이 지연될 수 있다[6]. 피부 노화의 주요 원인은 크게 내인성 노화와 외인성 노화로 나눌 수 있으며, 외인성노화 중 하나인 자외선은 피부의 광노화(photoaging)의 주요 원인 중 하나로 피부 주름, 색소침착, 탄력손실과 같은 노화 과정을 촉진시킨다[7]. 최근까지도 항산화, 주름개선과 같 항노화 효능을 갖는 소재에 대한 연구가 활발히 진행되고 있으며, 특히 식물을 이용한 추출물 형태의 많은 활성물질들이 개발되어왔다[8-11]. 식물 엑소좀(exosome)은 세포가 분비하는 나노크기의 세포외 소포체(extracellular vesicles)로, 세포 간 커뮤니케이션을 매개하여 다양한 생물학적 과정에서 중요한 역할을한다[12,13]. 엑소좀은 단백질, rna, dna 및 다양한 대사물질을 포함할 수 있으며, 이러한 물질들을 세포와 세포또는 식물과 식물간 정보를 전달하는데 이용된다[14,15]. 최근 연구에서는 식물 엑소좀이 식물뿐만 아니라 다른 생 물체와의 상호작용에도 중요한 역할을 한다는 연구 결과가 밝혀지고 있다[13,16]. 식물 엑소좀은 인지질 이중층으로 이루어져있어 생체 내에서 세포 흡수 및 생체적합성이 뛰어나다는 특징을 가고 있어 의학, 약학, 피부학 등 다양한 생명과학 분야에서 활발히 연구되고 있다[17]. 식물 엑소좀은 자연 유래의 안전한 전달 메커니즘으로서, 인체에
대한 부작용의 위험을 줄이면서도 효과적인 치료 결과를 도출할 수 있는 잠재력을 지니고 있다. 특히, 피부세포에 서의 엑소좀 연구는 피부 노화 방지 및 질병 치료법을 연구하는데 높은 가능성을 보여주고 있다[18,19].기존의 보고된 대부분의 연구에서는 식물 엑소좀이 다양한 생리활성 효과를 가진 소재로 인식하고 있음에도 불구하고 화장품 소재로서의 연구는 여전히 부족한 실정이다.따라서 본 연구에서는 울릉국화로부터 엑소좀(c. lucidum-derived extracellular vesicles, cldevs)을 분리하고, 피부 세포에서의 항노화 활성 효능을 세포실험 및 인체적용시험을 통해 항노화 화장품 소재로서의 활용 가능성을 평가하였다.
2. 재료 및 방법
2.1. 울릉국화 유래 엑소좀(cldevs) 분리
본 실험에 사용된 울릉국화(c. lucidum)는 농촌진흥청국립원예특작과학원(korea)으로부터 분양받아 사용하였다. 울릉국화는 7월에 수확된 건조되지 않은 생물의 전초를 흐 르는 물에 세척 후 착즙기(h-ah-nbf19, hurom, korea)를 이용해 30 rpm 조건으로 압착하고 8 µm paper filter (hm.02005380, hyundai micro, korea)를 이용하여 부유 입자를 제거하였다. 엑소좀을 분리하는 방법으로는 수성 2 단계 추출 시스템(atps)를 사용하였다[20,21]. 분자량이 10,000 ∼ 35,000인 polyethylene glycol (peg, mw 25,000 ∼45,000, sigma, usa)과 분자량이 300,000 ∼ 650,000인dextran (mw 450,000 ∼ 650,000, sigma, usa)을 각각 농
도가3.3%, 1.7%가 되도록 착즙물에 첨가하고, 1,000 x g, 4℃에서 10 min 동안 원심분리한 뒤 상층액을 제거하고 정제수로 세척하였다. 동일한 조건으로 한 번 더 원심분리하여 하층액에 존재하는 cldevs를 수득하였다.
2.2. 울릉국화 유래 엑소좀의 특성 분석
정제한 cldevs의 특성을 분석하기 위해 나노입자추적 분석기(nanoparticle tracking analyzer, nta), 저온전자현미경(cryo-transmission electron microscopy, cryo-tem), oilred o 염색을 실시하였다. cldevs의 크기 및 입자수를 확인하기 위해 시료를 정제수와 1 : 1,000으로 희석한 뒤 주사기를 이용해 nta nanosight lm10 (malvern instruments,uk) 기기에 주입하여 cldevs의 나노 입자 크기 및 농도를 측정한 뒤 nta software 2.3을 사용해 분석하였다. cryo-tem 이미징을 위해 cldevs를 레이시 카본 그리드위에 놓고 vitrobot mark iv (fei, usa)에서 동결하였다. cryo-tem 이미지는 high-sensitive tem ded (direct electron 울릉국화 엑소좀의 항노화 활성 효과 연구 j. soc. cosmet. sci. korea, vol. 50, no. 3, 2024 291detector) falcon iii (fei, usa)이 장착된 저온전자현미경titan krios 60-300 tem/stem (fei, usa)과 cs 이미지를이용하여 분석하였다. 이미지는 falcon ii ded를 사용하여18,000x 배율로 촬영하였다. cldevs의 인지질을 염색하기 위해 펠릿에 0.5% oil red o solution (sigma, usa)를 첨가 하고 10 min 동안 염색하였다. 염색된 cldevs는 원심분리를 통해 염색되지 않은 oil red o 용액을 제거한 뒤 현미경(eclipse ci-l, nikon, japan)을 이용해 사진을 측정하였다.
2.3. 인간 피부 세포 주 배양
본 실험에서 cldevs의 효능 평가를 위해 피부 각질세포(hacat, 300493, cytion, germany) 및 피부 섬유아세포(hdf, c-013-5c, gibco, usa)를 사용하였다. 10% fetalbovine serum (fbs, gibco, usa)을 포함시킨 high glucosedulbecco’s modified eagle’s medium (high glucose dmem,gibco, usa)을 포함한 배지를 사용하였으며, 37 ℃, 5%co2 조건의 세포배양기(mco-170aic, panasonic, japan)에서 배양하였다.
2.4. 세포 독성 평가(mtt assay)
cldevs의 세포 독성을 평가하기 위해 hacat 세포를 96well plate에 1 × 105 cells/ml이 되도록 분주한 후 세포배양기에서 18 h 동안 배양하였다. 이후 배지를 제거하고 pbs로 세척한 후 cldevs를 농도별(105, 106, 107, 108, 109particles/ml)로 새로운 배지와 함께 처리하고 24 h 동안 배양하였다. 그 후 세포의 생존율을 측정하기 위해 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (mtt,sigma-aldrich, usa) 용액을 5 mg/ml 농도로 첨가한 후 4h 동안 형성된 formazan을 dimethyl sulfoxide (dmso,sigma-aldrich, usa)로 녹이고 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.
2.5. 상처 회복 효능 평가(cell migration)
cldevs의 상처 회복 효능 평가를 위해 hacat 세포를 6well plate에 1 × 105 cells/ml이 되도록 분주한 후 세포배양기에서 18 h 동안 배양하였다. 이후 plate 바닥을 긁어 물리적 상처를 낸 뒤 배지를 제거하고 pbs로 세척한 후cldevs 108 particles/ml및 tgf-β1(양성대조군) 10 nm을
새로운 배지와 함께 넣고 18 h 배양하였다. 물리적 상처를낸 뒤 0 h 과 18 h 후 상처의 넓이를 측정하여 면적이 감소된 정도를 계산하였다.
2.6. quantitative real-time polymerase chain reaction(qrt-pcr)
cldevs의 피부 노화 억제 효능 평가를 위해 세포 외 기질 구성 인자인 col1a1과 col1a1의 분해 효소 중 하나인
mmp-1, 피부장벽 구조단백질인 loricrin 및 filaggrin의 유전자 발현을 평가하였다. col1a1 및 mmp-1 발현은hdf 세포를, lor 및 flg 발현은 hacat 세포를 사용하였으며, 각 세포를 24 well plate에 1 × 105 cells/ml이 되도록 분주한 후 세포 배양기에서 18 h 동안 배양하였다.mmp-1 발현 실험에서는 uvb를 조사(30 mj/cm2)하여 세포에서 mmp-1의 발현이 증가되도록 유도 하였다. 이후 배지를 제거하고, pbs로 세척한 후 세포에 적정 농도의cldevs (107, 108, 109 particles/ml) 및 양성대조군(tgf-β110 ng/ml, cacl2 10 nm)을 새로운 배지와 함께 넣고 48 h동안 배양하였다. 상등액을 제거하고 transzol (transgen,china) 과 scraper를 이용하여 배양이 끝난 세포를 용해한다음 13,000 rpm, 4 ℃, 30 min 조건으로 원심분리 하였다.rna가 있는 상층액을 분리하여 아이소프로판올을 상층액과 동량 넣어 혼합 후 13,000 rpm, 4 ℃, 30 min 조건으로원심분리 하였다. 침전된 rna를 제외한 상층액을 버리고남아있는 침전물에 70% 에탄올을 넣어 13,000 rpm, 4 ℃,10 min 조건으로 원심분리하여 세척하였다. 에탄올을 제거하고 상온에서 rna 침전물을 건조한 후 nuclease-freewater로 용해하여 total rna를 수득하였다. nanodrop을 이용하여 260/280 파장에서 rna의 순도 및 농도를 측정한뒤 그 범위가 2.0 ∼ 2.2 범위에 해당되는 것을 확인하였다. first cdna를 합성하기 위해 1 µg의 total rna와 oligodt (bionics, korea), dntp (takara korea biomedical, korea)와 혼합하여 65 ℃에서 5 min 반응시킨 뒤 m-mlv reversetranase (invitrogen, usa)를 이용하여 37 ℃에서 50min 간 반응시켜 합성하였다. 시료에 의한 세포에서의 유전자 발현 변화를 정량적으로 분석하기 위해 qrt-pcr을수행하였다. 각 유전자 primer, cdna, 2x sybr green pcrmaster mix, 정제수를 최종 20 µl로 혼합하여 linegene9600 plus real-time thermal cycler pcr system (bioer,china)를 사용하여 pcr을 진행하였다. gapdh 유전자는내부 정량 대조군으로 사용되었으며, 관련 유전자 발현 수준은 2-ΔΔct 방법으로 계산하였다[22]. 프라이머 서열은 primer 3
(https://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)을사용하여 디자인하였으며 사용한 유전자의 primer 서열은 table 1과 같다.
gene forward primer (5'-3') reverse primer (5'-3')
col1a1 agacatcccaccaatcacctg ggcagttcttggtctcgtcac
mmp-1 ctgcttacgaatttgccgacaga gttctagggaagccaaaggagctg
flg caatcaggcactcatcacac actgttagtgacctgactacc
lor cactggggttgggaggtagt gctctcatgatgctacccga
cdkn2a ccgaatagttacggtcggagg ggagaatcgaagcgctacct
tp53 tggctctgactgtaccacca tgatgatggtgaggatgggc
gapdh tgcaccaccaactgcttagc ggcatggactgtggtcatgag
table 1. pimer sequence in this study
대한화장품학회지, 제50권 제 3 호, 2024 292
10 min 조건으로 원심분리하여 세척하였다. 에탄올을 제거하고 상온에서 rna 침전물을 건조한 후 nuclease-free water로 용해하여 total rna를 수득하였다. nanodrop을 이용하여 260/280 파장에서 rna의 순도 및 농도를 측정한뒤 그 범위가 2.0 ∼ 2.2 범위에 해당되는 것을 확인하였다. first cdna를 합성하기 위해 1 µg의 total rna와 oligodt (bionics, korea), dntp (takara korea biomedical, korea)와 혼합하여 65 ℃에서 5 min 반응시킨 뒤 m-mlv reversetranase (invitrogen, usa)를 이용하여 37 ℃에서 50min 간 반응시켜 합성하였다. 시료에 의한 세포에서의 유전자 발현 변화를 정량적으로 분석하기 위해 qrt-pcr을수행하였다. 각 유전자 primer, cdna, 2x sybr green pcr
master mix, 정제수를 최종 20 µl로 혼합하여 linegene9600 plus real-time thermal cycler pcr system (bioer,china)를 사용하여 pcr을 진행하였다. gapdh 유전자는내부 정량 대조군으로 사용되었으며, 관련 유전자 발현 수준은 2-ΔΔct 방법으로 계산하였다[22]. 프라이머 서열은 primer 3(https://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)을사용하여 디자인하였으며 사용한 유전자의 primer 서열은 table 1과 같다.
2.7. h2o2처리를 통한 노화 억제 효능 평가
cldevs의 피부 노화 억제 효능 평가를 위해 hdf 세포를 24 well plate에 1 × 105 cells/ml이 되도록 분주한 후 세포배양기에서 24 h 동안 배양하였다. 이후 배지를 제거하고 pbs로 세척한 후 세포에 적정 농도의 cldevs (107, 108particles/ml)및 양성대조군(tgf-β1, 10 nm)을 새로운 배지와 함께 넣고 30 min 배양한 뒤, hydrogen peroxide(h2o2)를 1 mm이 되도록 처리한 뒤 24 h 동안 배양하여 노화를 유도하였다. 이후 세포를 수득하여 total rna 분리 및cdna를 합성한 뒤 노화 관련 유전자인 cdkn2a, tp53의 발현을 qrt-pcr을 통해 측정하였다.
2.8. 인체적용시험
2.8.1. 연구대상자
cldevs가 함유된 화장품(크림)의 주름(눈가, 팔자) 개선평가에 대한 인체적용시험을 위해 더케이생명윤리위원회(irb)의 심의를 거쳐 연구대상자를 모집한 후 2024 년 5월 20 일 ∼ 2024 년 6 월 19 일까지 진행되었다(irb 심의번호: irb-e2405-003). 피시험자는 만 48 ∼ 64 세 건강한성인 여성 22 명(평균연령 만 55.32 ± 5.03 세)을 대상으로진행되었다. 본 연구에서는 40 ∼ 60대의 노화가 진행된여성을 cldevs가 함유된 화장품의 타깃 사용 대상자로 선정함에 따라 해당 기준 설정에 적합한 성인 여성만을 대상으로 인체적용시험을 실시하였다. 시험담당자는 시험의 모
든 정보를 시험대상자에게 충분히 알렸으며, 시험 대상자는 자의에 따라 동의서를 작성하고 시험에 참가하였다.
2.8.2. 시험 방법
무작위배정(randomization)에 따라 각각 지정된 안면의오른쪽 또는 왼쪽에 cldevs가 함유된 시험제품(cldevcream)과 cldevs 함유하지 않은 대조제품(placebo)의 성분과 제품 번호 및 관계를 알 수 없도록 한 후, 시험제품 및대조제품을 지급받아 1 회 약 0.5 g을 취해 4 주간 1 일, 2
회 골고루 펴 발라 적용(도포)하도록 하였다. 제품 사용전, 사용 4 주 후 시점에서 눈가주름, 팔자주름 평가 및 이상 반응평가와 연구대상자에 의한 설문평가를 실시하였다.주름개선 측정은 antera 3dⓇ cs (miravex limited,ireland)를 이용하여 측정하였다. 본 연구에서는 제품 사용전, 사용 4 주 후 시점에서 눈가 및 팔자부위 주름을 측정하고 피부 주름 파라미터인 indentation index (µm)값을 분석하였다. 제품 사용 후 연구대상자에게 제품의 효능 및 사용성에 관한 설문평가를 진행하였다. 제품의 주관적 변화 정도를 5지선다(1, 매우 그렇지 않다; 2, 그렇지 않다; 3, 그런
편이다; 4, 그렇다; 5, 매우 그렇다)로 진행하였으며, 긍정적답변(3, 4, 5점)을 합산하여 분석하였다. 연구책임자 혹은 연구책임자로부터 위임을 받은 연구자는 연구대상자의 연구제품 사용 이후 이상반응 여부에 대해 관찰하여 기록하였다. 시험기간 동안 연구담당자와 연구대상자 간 질의 응
답을 통한 주관적, 객관적 자극 평가가 이루어지고 제품 사용 부위를 육안으로 평가하여 개인별 기록서에 기록하였다.
2.9. 통계처리
모든 실험 분석 값은 3 회 반복 실험을 통해 평균값과표준편차로 나타내었고 세포실험에서 각 군간 비교는sigmaplot을 이용한 t-test 분석을 실시하였다. 인체적용시험에서는 spss statistics 27 standard를 이용하였으며, wilcoxonsigned-rank test를 이용해 검증하였다. 대조군과 비교하여 p값이 0.05 미만일 때를 통계학적으로 유의성이 있다고 판정하였다.
3.결과 및 고찰
3.1. 울릉국화 유래 엑소좀(cldevs) 분리 및 특성 분석
식물 유래 세포외소포(plant derived extracellular vesicles, 울릉국화 엑소좀의 항노화 활성 효과 연구
j. soc. cosmet. sci. korea, vol. 50, no. 3, 2024293
pdevs)인 엑소좀을 분리하는 방법에는 대표적으로 초원심분리(ultracentrifuation), 접선 유동 여과(tangential flow
filtration, tff), 마이크로유체(microfluidics), 폴리머 침전(polymer precipitation) 및 면역친화성 포획(immunoaffinitycapture) 등이 있다[23]. 본 연구에서는 peg 및 dextran을이용한 폴리머 침전 방법을 통해 울릉국화 유래 엑소좀(cldevs)을 분리하였다. cldevs를 정량화 하기 위해 나노입자추적분석기를 이용해 cldevs의 나노 입자크기 및 수율을 측정한 결과, 평균사이즈가 134.9 nm이며, 수율이 1.6× 109 particles/ml임을 확인하였다(figure 1a).대부분의 연구에서 엑소좀을 투과전자현미경(transmissionelectron microscopy, tem)을 이용하여 시각화 하고 있다 [24-26]. 분리한 cldevs를 cryo-tem을 이용해 시각화 한결과, 200 nm 미만의 구형 나노 입자를 관찰할 수 있었다 (figure 1b).
oil red o (oro)는 중성 지질 및 지단백질을 염색하는데 사용되는 지용성 염료로, 세포 투과성이 높아 세포 내
지질 염색에도 널리 사용되고 있으며, 주황색-붉은색으로염색된다[27,28]. 엑소좀이 인지질로 이루어져 있다는 특성을 이용해, oro 염색을 통해 인지질이 염색된 엑소좀을시각화 할 수 있다[29]. 본 연구에서 cldevs를 oro 시약을 이용해 염색한 결과, 붉은 색으로 염색된 구형의 나노
입자들이 관찰되는 것을 확인하였다(figure 1c). 상기 결과들은 일반적인 pdevs의 크기 범위인 직경 50 ∼ 300 nm기준에 포함되는 것으로 보인다[30].
3.2. 피부 세포 독성 평가
a b c
figure 1. size and distribution profiles of c. lucidum derived exosomes (cldevs) as determined by nanoparticle tracking analysis
(nta), cryo-tem and oil red o staining. (a) size and distribution of cldevs using nta. (b) cryo-tem analysis. (c) oil red o
staining analysis.
figure 2. hacat cell viability as a function of cldevs treatment
concentration (mtt assay). results are presented as mean ± sd.
대한화장품학회지, 제50권 제 3 호, 2024294
cldevs가 피부 각질 세포인 hacat 세포의 생존 능력에영향을 미치는지 알아보기 위하여 mtt assay를 수행한 결과, cldevs를 농도별(0, 105, 106, 107, 108, 109 particles/ml)로 24 h 처리했을 때, 각각 농도 별 세포 생존율은 각각 100, 113, 118, 116, 105, 101%로 0 particles/ml 처리 대비 105, 106, 107 particles/ml 처리했을 때 오히려 세포의 생장이 증진되었으며, 109 particles/ml 까지의 처리 농도 범위에서 세포 생존 능력에 영향을 미치지 않는 것을 확인하였다(figure 2). 본 결과를 통해 cldevs가 hacat 세포에 독성을 나타내지 않는다는 것을 확인하였다.
3.3. 상처 회복 효능 평가
cldevs가 hacat세포의 이동 능력에 대한 영향을 확인하기 위해 상처 치유 실험(wound healing analysis)를 수행
한 결과, cldevs를 108 particles/ml의 농도로 18 h 처리했을 때 대조군과 비교했을 때, 상처의 면적 감소율이 33.65%에서 58.48%로 약 73.8% 더 빨리 감소되는 것을 확 인하였다(figure 3). 본 결과를 통해 cldevs가 피부 각질
세포인 hacat 세포의 재생 및 상처 치유에 효과를 나타낼수 있다는 것을 확인하였다.
3.4. 주름 및 피부 장벽 개선 효능 평가
진피는 섬유성분과 기질성분으로 구성되어 있으며, 콜라겐은 섬유성분 중 하나로 진피층의 90%를 차지하고, 피부의 강도와 장력을 유지 및 피부를 보호하는 역할을 한다
[31]. 콜라겐은 섬유아세포에서 col1a1과 같은 합성 효소
a b
108 10 ng/ml0
concentration
107 109
particles/ml 108 10 ng/ml0
concentration
107 109
particles/ml
0
uvb - + + + + +
figure 4. effect of cldevson the expression of collagen biosynthesis related biomarkers. gene expression of col1a1 (a) and
mmp-1 (b) in hdf cells. results are presented as mean ± sd. **p < 0.01, ***p < 0.001.
18h0h
blank
cldevs
(108 particles/ml)
tgf-beta 1
(10 ng/ml)
a b
108 particles/ml 10 ng/ml0
concentration
**
figure 3. results from wound healing assays. (a) percentage of wound closure for 18 h. (b) cell scratch assay results. results are
presented as mean ± sd.
**p < 0.01,
***p < 0.001.
울릉국화 엑소좀의 항노화 활성 효과 연구
j. soc. cosmet. sci. korea, vol. 50, no. 3, 2024
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에 의해 생성되며, matrix metallo proteinase-1 (mmp-1)과같은 collagenase에 의해 분해된다[32,33]. cldevs가 hacat세포와 hdf 세포에서 주름 및 피부 장벽과 관련된 영향을확인하기 위해 각 세포에 cldevs를 농도별로 48 h 처리한뒤 hacat세포에서는 col1a1 및 mmp-1를, hdf세포에서는 flg 및 lor의 발현을 확인하였다. 그 결과, cldevs처리 농도 범위(107, 108, 109 particles/ml)에서 대조군 대비
col1a1의 발현은 각각 94.2%, 99.8%, 104% 증가되었으나(figure 4a), mmp-1의 발현은 uvb가 처리된 대조군 대비 각각 2.3, 3.4, 4.7%로 거의 변화가 없는 것이 확인되었다(figure 4b). flg의 발현의 경우, 대조군 대비 각각 50.0%, 33.1%, 32.9% 증가되었으며(figure 5a), lor의 발현 또한 각각 15.5%, 27.7%, 39.9% 증가된 것을 확인하였다(figure5c). 본 결과를 통해 cldevs가 콜라겐 생합성에서는
mmp-1의 발현 감소에는 영향을 미치지 않으나, 콜라겐 및구조단백질의 생합성 활성화를 통해 주름 및 피부 장벽 개선에 효과를 나타낼 수 있다는 것을 확인하였다.
3.5. 노화 인자 억제 효능 평가
p16는 cdkn2a 유전자로부터 발현되는 단백질로, cyclind (cdk4)를 억제함으로써 세포주기를 중단시키고 노화를유도하는 것으로 알려져 있다[34-36]. 나이가 들면서 세포에서 p16의 발현이 증가되며, 이로 인해 세포들이 정상적으로 분열하지 못하게 되면서 관련된 노화 질환의 발병에기여한다고 알려져 있다[37]. p53은 tp53 유전자로부터 발현되는 단백질로, 암세포 억제 유전자로 잘 알려져 있으나,이는 p53이 세포의 노화를 촉진시켜 세포 사멸을 유도하는 것으로 알려져 있다. p53은 세포 주기의 진행을 담당하
는 cyclin-dependent kinase (cdk) inhibitor인 p21의 발현을활성화시켜 cdk의 활성을 저해하여 세포 주기를 조절한다. 특히 노화과정에서 과도한 ros 축적은 p53-p21 경로가활성화되어 세포 노화가 유도된다고 알려져 있다[38,39].cldevs가 h2o2에 의해 노화가 유도된 hdf 세포에서 cdkn2a및 tp53의 발현 억제 효과를 확인한 결과, cldevs를 107및 108 particles/ml 처리했을 때, 대조군 대비 cdkn2a의
경우 각각 69.01%, 72.95% 감소 되었으며(figure 6a), tp53의 경우 각각 23.15%, 51.69% 감소 된 것을 확인하였다(figure 6b). 본 결과를 통해 cldevs가 노화에 의해 유도된 cdkn2a에 대하여 높은 억제 효과를 보이며, 이를 통해 세포 노화 억제 효과를 나타낼 수 있다는 것을 확인하였다.
3.6. 주름개선 평가에 대한 인체적용시험
세포 실험에서 cldevs의 항노화 효과 인체에서 실제적으로 주름 개선에 도움을 주는지 확인하기 위하여 cldevs를 in vitro 시험 결과에서 효능을 보인 최소 농도 107particles/ml가 최종 함량이 될 수 있도록 cldevs를 5% 처방한 화장료(cldev cream)와 cldevs를 함유하지 않은 화장료(placebo)를 제조하여 인체 적용 시험을 실시하였다.만 48 ∼ 64 세의 성인 여성 22 명을 대상으로 시료 도포
a
††
b
baseline after 4 weeks
cldev
cream
placebo
baseline after 4 weeks
cldev
cream
placebo
††
figure 7. results of human application tests for wrinkle improvement on cosmetics containing cldevs. evaluation of improvement in
wrinkles around the eyes (a) and in nasolabial folds (b). results are presented as mean ± sd. ***p < 0.001 (significant difference
compared to baseline), ††p < 0.01 (significant difference compared to the groups).
울릉국화 엑소좀의 항노화 활성 효과 연구
j. soc. cosmet. sci. korea, vol. 50, no. 3, 2024
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전, 시료 도포 4 주 후 시험자들을 대상으로 눈가주름 및팔자주름 개선 정도를 확인하였다. 그 결과, cldev cream및 placebo 제품 사용 4 주 후 시점에서 눈가주름 변화율이 각각 10.89%, 5.75% 감소하였으며(figure 7a), 팔자주름의 경우 각각 7.88%, 5.14% 감소된 것을 확인하였다(figure7b). cldev cream과 placebo 제품군간 비교시, 4 주 후 시점에서 cldev ceam을 사용했을 때, placebo 제품에 비해유의하게 감소된 것을 확인하였다.
4.결 론
본 연구에서는 울릉국화 유래 엑소좀인cldevs를 분리하여 주름 개선, 피부장벽 개선 및 노화 억제에 대한 효과를 평가하였다. 세포실험 및 인체적용시험 결과, cldevs는주름개선 및 노화 억제에 우수한 효과를 보였으며, cldevs를 함유한 화장료(cldev cream)는 피부 자극 없이 우수한주름 개선 효과를 보였다. 결론적으로, cldevs는 항노화및 주름개선에 탁월한 효과를 보이는 신규 천연 바이오 소재로서의 활용 가능성을 증명하였다. 주름과 같은 피부노화를 늦추기 위한 새로운 기능성 화장품에 대한 소비자의니즈가 증가되면서 관련된 연구들이 활발히 진행되고 있
다. 식물 유래 엑소좀은 다양한 유효물질을 담지할 수 있 인지질 이중층으로 구성되어 생체적합성이 높고, 낮은독성 및 면역원성을 보이며, 막단백질 등을 통해 특정 표적화 능력을 가질 수 있다. 또한, 대량생산이 용이하다는 점에서 추출물을 대체할 수 있는 새로운 소재로서 각광받고있다[40]. 선행 연구에서 식물 유래 엑소좀은 –100 mv ∼ 0mv 범위의 음의 제타 전위를 보이며, 이는 엑소좀이 상호배타적으로 응집의 경향이 적으며, 다양한 온도 및 ph에서 안정적으로 유지될 수 있다는 것이 확인되었다[41]. 이러한 선행 연구를 바탕으로 다양한 화장품 제형내에서 식물유래 엑소좀의 안정성이 유지될 가능성이 높을 것으로 예상되나, 아직까지 제형내에서 식물 유래 엑소좀을 검증할 수있는 기술에 대해서는 더욱 구체적인 연구가 필요하다.
acknowledgement
본 논문은 2023년도 과학기술정보통신부의 재원으로 과
학벨트기능지구지원사업의 지원을 받아 수행된 연구임
(1711202435).
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